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    中文名:G418储存液(20mg/ml)

    英文名:Geneticin 418 Solution

    CAS:N/A

    级别:N/A

    分子量:N/A

    分子式:N/A

    纯度:N/A

    储存条件:-20°C

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    万博哪里下载编号 规格 目录价(¥) 优惠价(¥) 数量 操作
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    万博哪里下载简介

    关于G418

    G418 Sulfate(G418硫酸盐),也称作Geneticin(遗传霉素),是一种结构类似于庆大霉素B1(Gentamycin B1)的氨基糖苷类抗生素,通过影响80S核糖体功能和阻断延伸步骤来干扰蛋白合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、高等植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。其抗性基因(主要为neo基因)位于转座子Tn601(903)或Tn5(来源于细菌),但是可以在真核细胞中表达。通过基因重组技术将这些抗性基因导入细胞,使其获得对G418的耐药性,从而用来筛选和维持培养携带抗性基因的原核或者真核细胞。
    哺乳动物细胞中,当抗性基因neo被整合进真核细胞基因组后,使其编码表达氨基糖苷磷酸转移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase,APH(3)II)。此酶通过共价修饰G418的氨基或羟基功能,抑制抗生素-核糖体间的相互作用,从而使得抗生素失活。这一特性赋予细胞产生抗性。稳转细胞株筛选实验,需要建立杀灭曲线(剂量反应曲线)确定杀死无抗性细胞的最低有效浓度。
    植物细胞中,通过转染携带nptII基因的抗性质粒孵育其抗性。nptII基因也能编码表达氨基糖苷磷酸转移酶,这个酶使得多种抗生素丧失活性,包括G418,卡那霉素和巴龙霉素。
    使用方法
    1. G418储存液的配制(50 mg/mL,活性浓度)
    1、活力单位的换算
    根据公式换算:(1000/A0)×A1=A2,其中A0是G418的活力值(Potency),因批次而异,可见批次对应的质检报告,或者瓶子上的标签。A1是想配制的活性G418浓度。A2是实际称重的粉末与体积比浓度。
    例如:G418活力值为:750 µg
    ,要配制50 mg/mL的G418活性浓度,则实际要配制的粉末浓度为1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。如果配制10 mL的G418储存液(活性浓度,50 mg/mL),则需要称取663.3 mg粉末。
    2、除菌和保存
    根据上述换算得到的实际粉末称重,加入10 mL无菌去离子水内使其完全溶解。0.22 μm过滤,除菌后分装放到-20℃冻存,1年稳定。
    注:不建议使用液体新万博manbetx下载app、氯化钠溶液、磷酸盐溶液,或者有机溶剂来制备储存液。
    2.常用筛选浓度
    通常情况,哺乳动物细胞筛选范围200-2000 μg/mL;植物细胞:10-100 μg/mL;酵母细胞:500-1000 μg/mL。
    刚开始筛选转化子需要高浓度的G418,后续用较低浓度的G418维持培养。生长条件、细胞类型、环境因素都可能影响G418的用量,因此建议新建实验体系通过杀灭曲线(kill curve),即剂量反应性曲线,来确定最佳筛选浓度。
    不同细胞类型使用G418筛选使用的浓度:

    细胞类型

    激活浓度(μg/mL

    应用

    网柄菌属

    10

    培养液培养

    30

    冻干细菌培养

    哺乳动物

    400-1000

    筛选

    200

    维持生长

    植物

    25-50

    筛选

    10

    维持生长

    酵母

    500

    筛选

    125-200

    维持生长

    细菌

    8-16

    筛选

    3.杀灭曲线的建立
    通常情况,哺乳动物细胞筛选范围200-2000 μg/mL;植物细胞:10-100 μg/mL;酵母细胞:500-1000 μg/mL。
    为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株,需要确定能够杀死未转染宿主细胞的抗生素最低浓度,可通过建立杀灭曲线(剂量反应曲线
    )来实现,至少选择6个浓度。处理分裂期的细胞时G418的活性最强,因此在添加G418之前需要让细胞培养一段时间。
    1、按照20-25%的细胞密度将未转化的细胞铺在合适的培养板上,37℃,CO2过夜培养(需要更高密度,可增加接种量)。
    2、根据细胞类型,设定合适的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例,可设定50,100,250,500,750,1000μg/mL。
    3、第2天换用新鲜配制的含有相应浓度药物的新万博manbetx下载app,每个浓度做三个平行孔。
    4、接下来每3-4天更换新的含药物新万博manbetx下载app。
    5、按照每2天进行活细胞计数,来确定杀灭未转染细胞的恰当浓度。通常7-10天内能够杀死绝大多数细胞的最低浓度为筛选用的工作浓度。
    稳定转染细胞的筛选
    1、转染48 h后,用含有适当浓度的G418筛选新万博manbetx下载app来传代细胞(直接传代或者稀释后传代)。
    注:细胞处于活跃分裂状态时抗生素的杀伤效果最好。则当细胞过于稠密,其效率会降低,最好将细胞稀释至丰度低于25%。
    2、每隔3-4天更换含有药物的筛选培养液。
    3、筛选7天后观察并评估细胞克隆(集落)的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间,这取决于宿主细胞类型,转染,以及筛选效果。
    4、挑取并转移5-10个抗性克隆于35 mm细胞培养板,继续用含药物的筛选培养液维持培养7天。
    5、后续更换正常新万博manbetx下载app培养即可。
    注意事项
    1、G418不可高压灭菌;
    2、G418不要和其他的抗生素/抗真菌剂(如青霉素/链霉素)共同使用,因为它们是G418的竞争性抑制剂。其它的抗生素会产生交叉活性。
    3、配制G418溶液时,要换算不同批次G418的活力值(potency),从而得到需要活性浓度的储存液以及工作液。
    4、加入G418的培养体系,未转染的细胞未被杀死,可能因为药物浓度过低,或者细胞密度过高。快速分裂的细胞相对于缓慢增殖细胞,更容易被杀死。添加抗生素5-7天后可能才会杀死对照细胞(未转染),转染细胞(抗性克隆子)的克隆需要10-14天形成。
    5、加入致死剂量的G418,细胞可能还会继续分裂2-3次。G418的药效通常在2天后才变得明显。
    6、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 

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