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    中文名:毕赤酵母转化试剂盒

    英文名:Pichia pastoris positive clone assay kit

    CAS:N/A

    级别:N/A

    分子量:N/A

    分子式:N/A

    纯度:N/A

    储存条件:-20℃

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    万博哪里下载编号 规格 目录价(¥) 优惠价(¥) 数量 操作
    20T
    698
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    万博哪里下载简介

    储存条件: -20 ℃保存,未开封有效期24个月。

    万博哪里下载内容:

    11.png


    一、毕赤酵母感受态细胞的制备

    1.活化菌种。-80 ℃保存的菌种在固体YPD新万博manbetx下载app平板上划线,30 ℃培养2-4天。

    2.选取酵母菌落接种到10 mL液体YPD新万博manbetx下载app中,30 ℃摇床过夜培养后将培养物按1%的接种量接种到100 mL液体YPD新万博manbetx下载app中三角瓶中培养至OD值为0.6-1.0。

    注:每10 mL菌液可用于一次转化。以下操作步骤适用于10 mL菌液。

    3.3,000 rpm离心3 min收集菌体沉淀。

    4.加入5 mL B1溶液重悬菌体,3,000 rpm离心3 min收集菌体沉淀。

    5.再加入200 μL B1溶液重悬菌体,转移到无菌1.5 mL离心管,即为制备好的感受态细胞,可直接用于转化或冻存备用。

    6. 制备好的感受态细胞需缓慢冷冻后,再置于-80 ℃冰箱长期保存。将感受态细胞放入程序降温盒,或用多层纸包裹放入泡沫盒中,先置于-80 ℃冰箱过夜后,再取出感受态置于-80 ℃冰箱,可保存半年。使用前冰上解冻或直接用于转化。

    注:缓慢冷冻会保证良好的转化效率。扩大酵母菌培养体积,相应增加冻存液的使用量,可以一次性制备多只毕赤酵母感受态细胞。


    二、毕赤酵母转化

    1.取0.1-5 μg质粒DNA(线性化质粒加入量5-50 μg)和10 μL预变性Carrier DNA加入到未融化的感受态细胞上,置于30 ℃水浴,每隔15 s颠倒混匀,直至感受态细胞刚好完全融化。(融化后及时取出)

    2.加入1.4 mL B2溶液颠倒混匀。30 ℃水浴60 min。

    3.3,000 rpm离心3 min弃上清留菌体沉淀,加入1 mL B3溶液重悬菌体。

    4.3,000 rpm 离心3 min 弃上清留菌体沉淀,加入100 μL B3溶液重悬菌体。

    5.将100 μL菌液全部涂布到相应的平板新万博manbetx下载app,30 ℃恒温培养3-5天,直至平板出现酵母克隆。

    注意事项:初次使用Carrier DNA,请把装有Carrier DNA的管子在沸水中煮沸5 min,然后立即放在冰上,用后放在-20 ℃储存备用。下次使用前请于冰上解冻Carrier DNA。反复冻融3-5次后需重新变性Carrier DNA。


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