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    中文名:碱性磷酸酶

    英文名:Phophatase Alkaline,Calf Intestine(CIPA)

    CAS:9001-78-9

    级别:Reagent Grada

    分子量:N/A

    分子式:N/A

    纯度:≥1500 units/mg

    储存条件:-20℃

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    万博哪里下载简介

    Coolaber的碱性磷酸酶来源于牛肠粘膜。

    牛肠碱性磷酸酶为二聚膜衍生糖蛋白。至少存在三种同工酶,每个单体通常拥有两个 N-连接多糖和一个或多个 O-连接多糖。该酶需要锌以及镁或钙二价离子才能显示活性。

    单位定义:在pH 9.8,37℃条件下,一个DEA单位可每分钟水解1 μmole的4-硝基苯基磷酸酯。(一个甘氨酸单位相当于~3个DEA单位)。

    应用:碱性磷酸酶可用于酪蛋白和其他蛋白质的去磷酸化。碱性磷酸酶还可用于 DNA 或 RNA 的 5′-末端的去磷酸化,以防止自我连接。经碱性磷酸酶的去磷酸化作用后,DNA 或 RNA 还可被放射性标记磷酸盐标记(通过 T4 多核苷酸激酶)。

    高浓度的酶稳定性更高。Coolaber的碱性磷酸酶以高浓度母液形式提供,并附赠稀释液(含Mg2+,Zn2+,甘油等)和10×反应缓冲液。

    万博哪里下载组成:

    1.png

    使用方法(以之为例):

    1. 在微量离心管中配制 50 μL 反应体系: 

    (DNA Fragment  1~20 pmol;10×反应液 5μL ;碱性磷酸酶 30U ;补水到50μL)

    2. 37℃或 50℃反应 30 分钟。或者先 37℃反应 15 分钟,再 50℃反应 15 分钟。注 意:单链 DNA 和具有 5’突出末端 的 DNA 在较低温度下(如 37℃)即可去磷 酸化,而具有 3’突出末端的 DNA 或平末端 DNA 需要较高温度(如 50℃)才能 去磷酸化。

    3. 苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提 2 次。注意:如果早在苯酚抽提之前,用 自备的蛋白酶 K 降解 CIAP 酶,则效果更好。具体做法是:加入 EDTA 和 SDS 使其终浓度为 5 mM EDTA 和 0.5% SDS,最后加入蛋白酶 K 溶液,使其终浓度 为 50 μg/mL,然后 56℃处理 30 分钟,再 75℃孵育 10 分钟。然后用于苯酚/ 氯仿/异戊醇抽提。 

    4. 氯仿/异戊醇(24:1)抽提 1 次。 

    5. 添加 2.5 μl 的 3 M NaCl(终浓度 150 mM)。 

    6. 添加 125 μl 的(2.5 倍量)冷乙醇,在-20℃下放置 30~60 分钟。 

    7. 13000g 离心 20 分钟后,小心去上清。 

    8. 用 1mL 75%乙醇洗涤一次。 

    9. 干甩数秒,小心吸弃上清。 

    10. 用 20 μl 以下的 TE Buffer 溶解 DNA 沉淀待用或放-20℃长期放置。


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